Färgämnesframtagning ur löv genom TLC

 

Färgämnesframtagning ur löv genom TLC

 

Inledning

Syftet med laborationen är att utreda vilka färgämnen som finns i löv från olika sorters träd och buskar. Genom tunnskiktskromatografi separeras färgämnena från varandra vilket möjliggör större analysmöjligheter, så att samtliga färgämnen kan skådas.

 

Teori

Tunnskiktskromatografi är en kromatografisk metod som används för att undersöka kemikalier och dess egenskaper. Tunnskiktskromatografi används främst för att separera ämnen från varandra så att exempelvis alla komponenter i en lösning kan skådas eller för att göra ett renhetstest. Polariteten i molekyler och joner utnyttjas för separeringen. Detta sker med hjälp av en mobil fas och en stationär fas. En tunnskiktsplatta skapas genom att en platta beläggs med den stationära fasen, vilket är ett poröst fast ämne. Vilket ämne som används kan varieras men det är essentiellt att den antingen är polär eller opolär och att detta är känt. Vanliga ämnen som används till den stationära fasen är kiselgel, aluminiumoxid och cellulosa. Den mobila fasen ska ha den motsatta polariteten och vara i vätskeform. Ofta består den av en blandning av flera olika vätskor. Den mobila fasens syfte är att transportera kemikalierna med sig uppåt på tunnskiktsplattan, och eftersom olika ämnen är olika benägna att röra på sig kommer de att separeras efter sin polaritet. De hamnar alltså på olika höjder, och hamnar flera olika prover på samma nivå och har samma färg är det samma ämne. Kemikalierna som ska testas torkas in på plattan innan de placeras ut med botten av plattan doppad i den mobila fasen så att vätskan kan stiga. Det är kapillärkraften som hjälper vätskan att stiga och ta med sig proverna. Det innebär också att resultatet kan bli något missvisande om proverna är för nära kanterna av plattan.

 

Växterna som användes till laborationen innehåller alla färgpigment. Genom att sönderdela och mosa bladen kommer pigmenten ut och kan testas för att se vilka färgpigment som förekommer i det genom kromatografin. Färgämnena är av olika sorter – vattenlösliga och fettlösliga – och deras egenskaper skiljer sig åt. De fettlösliga kallas karotenoider och kan delas in i ytterligare två grupper, karotener och xantofyller. Xantofyllerna innehåller syre och är därför mer polära. Eftersom att plattan är polär i denna laboration kommer xantofyllerna trivas bättre i den stationära fasen och karotenerna i den mobila fasen. Tabell 1 visar vilka färgämnen som kan förekomma i löv och utifrån namnen kan de flesta indelas i grupperna.

 

Tabell 1: Färger för kemikalier som kan finnas i löv (från laborationshandledningen)

 

Betakaroten            orange eller gul
Feofytin                  grågrön
Klorofyll a              blågrön eller olivgrön
Klorofyll b              grön eller ljust grågrön
Violaxantin             gul?
Neoxantan              gul?
Kryproxantan         gul
Zeaxantin               brungul
Lutein                     gul

 

Metod

Laborationen inleddes med att samla ihop löv. Vilken växtart som löven tillhörde antecknades och en rimlig mängd mättes upp. I detta fall användes ett blad från en vinbärsbuske. Lövet sönderdelades sedan till mindre bitar med hjälp av en sax och placerades i en mortel. Den lämnades sedan där och en bit tunnskiktsplatta i lämplig storlek klipptes ut ur arket. Genom att behandlas med kiseldioxid har den blivit polär. Plattan måste få plats i en hög bägare/elueringskärlet och får alltså inte vara högre än kärlet, men den bör samtidigt vara tillräckligt stor för att ha provlösningarna minst 1 cm ifrån kanten och 1,5 cm upp från botten, samt rimligt avstånd mellan provlösningarna. Den ska vara tillräckligt hög för att enkelt kunna urskilja färgämnena när de stiger i olika takt mot toppen. Beröring och fingertryck stör processen och kan eventuellt påverka resultatet, så det bör undvikas genom att hålla plattan i kanten.

 

Efter att tunnskiktsplattan är utklippt kan elueringslösningen börja beredas i ett dragskåp. I ett mätglas ska aceton, n-pentan och petroleumeter blandas enligt förhållandet 3:3:7. Den totala mängden som ska blandas beror på hur många tunnskiktsplattor som ska doppas, men varje tunnskiktsplatta ska doppas i elueringslösning vars nivå är lägre än provlösningarna på plattan, och således behövs inte särskilt mycket i varje kärl. Elueringslösningen ska blandas väl innan den överförs till den höga bägaren/elueringskärlet som plattan ska doppas i, och om den inte brukas omedelbart ska kärlet täckas med parafilm.

 

När elueringslösningen och tunnskiktsplattan är förberedda kan provlösningen börja beredas. Cirka 5 ml aceton ska tillsättas till de sönderklippta bladen i morteln, vilket sker under dragskåp. Med hjälp av morteln ska dessa blandas så att en grön flytande lösning erhålls. Då acetonet avdunstar under tiden, kommer tillsättning av ytterligare aceton krävas. När lösningen är färdigberedd ska ett kapillärrör eller en mikropipett användas för att suga upp lösningen. Denna ska sedan överföras till tunnskiktsplattan. Det kan vara en knepig process, så det skadar inte att öva innan på en annan platta. Provlösningen ska sättas ut på en rimlig plats beroende på hur många lösningar som ska testas. Hela kapillärröret bör tömmas för att få bästa möjliga effekt, men det bör ske i flera omgångar, så att provlösningarna får en fin och kompakt form på plattan. Detta ska upprepas med samtliga provlösningar som ska undersökas. De som undersöktes i denna laboration är vinbärsbuske, alm och murgröna.

 

Tunnskiktsplattan ska sedan placeras ut på högkant i elueringskärlet, som täcks med parafilm. Efter cirka 10–30 minuter bör elueringsvätskan ha stigit upp till bara någon enstaka centimeter från toppen av plattan. Då är beredningen redo. Ta ut plattan och torka den några minuter. Därefter ska det vara möjligt att se olika färger som vandrat upp från den ursprungliga provlösningspunkten, vilket visar de olika färgämnena.

 

Resultat

De färgämnen som förekom i de olika löven var i stort sett likadana, även om det förekom olikheter. Vinbärsbusken hade flest typer av färgämnen i sig, då fem olika färgämnen fanns. I både almen och murgrönan hittades fyra olika färgämnen. I almen och murgrönan fanns det två sorters gula färgämnen, ett grönt och ett gulblått. Att de befinner sig på samma höjd på plattan indikerar att det är samma sorts färgämne. Vinbärsbusken innehåller alla ovan nämnda färger, men det förekom även en grågrönaktig färg. I samtliga fall steg ett gult färgämne väldigt högt och befann sig ungefär vid toppen av vätskenivån under hela tiden som plattan stod i elueringslösningen, vilket kan ses i både figur 1 och figur 2. Hos vinbärsbusken var det näst snabbaste färgämnet det grågrönaktiga. I både murgröna och alm var den blågröna färgen något snabbare än den gröna, och den andra gula färgen var långsammast. Denna ordningen stämde också in på vinbärsbusken efter den grågröna färgens position.

  

 

 

Figur 1: Bilden visar tunnskiktsplattan efter att den tagits upp ur elueringslösningen och torkats. Längst till vänster finns vinbärsbusklösningen, i mitten finns almlösningen och längst till höger murgrönelösningen.

 

 

Figur 2: Bilden visar tunnskiktsplattan i elueringskärlet efter en liten stund. Ordningen är densamma som i figur 1.

 

Diskussion

De olika bladens ursprung skiljer sig, alm är ett träd, murgröna är en lian (klätterväxt), och vinbärsbusken är givetvis en buske. Därför är det väldigt intressant att utreda hur färgämnena kan skilja sig över släktena. Som sagt förekom det 4 olika färgämnen i både murgrönan och almen, vilka enligt resultatet borde vara samma, då deras polaritetsidentitet är likadan eftersom de stigit exakt lika mycket. Fyra av de fem färgämnena från vinbärsbusken är också identiska med resultaten från almen och murgrönan. Det snabbaste och därmed minst polära färgämnet var ett av de gula. Enligt tabell 1 är det svårt att avgöra vilka färgämnen de gula är eftersom det finns många att välja på. Däremot tenderar karotenoider ju att stiga fortare än xantofyller, så den översta gula bör vara betakaroten, då både färgen och egenskapen stämmer in. Den grågrönaktiga färgen som endast fanns i vinbärsbusken var den näst mest mobila provlösningen. Enligt tabellen borde det vara feofyntin, vilket är ett klorofylliknande ämne där skillnaden är att magnesiumjoner saknas. Den blågröna färgen kommer härnäst och enligt tabellen måste det i princip vara klorofyll a. Den gröna färgen som kommer nära därpå är med stor sannolikhet klorofyll av typen b. Skillnaden mellan typerna av klorofyll är att de absorberar ljus av olika våglängder, och emitterar därför lite olika typer av ljus vilket ger upphov till färgskillnaden. Den sista gula färgen som finns hos samtliga är svårare att bestämma. Det finns flera alternativ bland karotenoiderna, men eftersom att den var den största avvisaren av den mobila fasen bör den ha störst polaritet. Därför bör den tillhöra gruppen av xantofyller. Enligt tabellen är något av lutein, kryproxantan, neoxantan och violaxantan det ämne som den gula kemikalie tillhör med störst sannolikhet.

 

En intressant observation är att färgernas styrka varierade väldigt mycket under experimentets gång. Detta kan ses genom att jämföra figur 1 och 2. Skillnaden fortsatte också att växa efter att bilden i figur 1 togs. Eftersom färgernas klarhet påverkas kan det bli svårare att avgöra nyanser av färgen som kan vara viktiga för ämnesbestämmelsen. Detta kan vara en potentiell felkälla, speciellt om målet är att framställa ett specifikt ämne. Under laborationer gjorde alla grupper prover på flera lövsorter. Flera resultat har därför erhållits för varje växttyp. För murgrönan utfördes fyra prover, och samtliga resulterade i fyra olika färgämnen. Därför är resultaten väldigt rimliga. För vinbärsbusken utfördes endast två prover. I resultatet för den här laborationsrapporten erhölls fem färgämnen, men endast fyra erhölls i den andra laborationen. Då det är få prover är det svårt att med säkerhet dra slutsatser om vinbärsbuskens karaktär. I almlösningen, som testades tre gånger, blev resultaten sex, sex och fyra färgämnen. Det tyder på att det finns fler färgämnen i almen än vad som framkom under denna laboration. Därför varierar tillförlitligheten något för resultaten, och en bra metod för att öka den vore att testa flera gånger med flera olika blad. Vissa provlösningar fick en högre koncentration än andra och därmed starkare pigment. Detta kan ha inverkan på hur färgen se ut, så även om det är svårt att få en bestämd mängd aceton då den avdunstar, hade det varit bra med ett riktmärke så att koncentrationerna är någorlunda lika. Det som överfördes till plattan varierade även lite, då ett kapillärrör skulle fyllas och duttas ner, vilket kan ge upphov till små variationer i volymen av provlösningen. Den pågående hösten har också sin påverkan på lövens karaktär. Under denna årstid brukar många löv skifta färg och falla ner på marken. Då kan rubbningar i pigmentet uppstå och skapa skillnader mellan löv beroende på hur långt de kommit i sin utveckling.

 

Källor:

Powerpointen Kemisk Analys

Powerpoint från kemilketioner.se

Läroboken– Gymnasiekemi 2